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    如何檢測你的細胞是否收到支原體的入侵呢?
    點擊次數:129 發布時間:2022-08-18

    細胞培養被支原體污染是個世界性問題,在細胞培養中支原體感染發生率達到63%。支原體是一類無細胞壁,形態呈高度多形性,為圓形、絲狀或梨形,其直徑僅有0.13~0.18μm,變形能力大,故能通過濾菌器,突出的結構特征是沒有細胞壁,對作用于細胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明,支原體能耗盡營養物,促進代謝積累,導致pH改變,對細胞造成多種影響,包括生長狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細胞存活等多方面的改變,繼而干擾實驗結果,或造成無法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細胞幾乎是不可能的。

    那如何檢測你的細胞是否收到支原體的入侵呢?下面介紹了幾種檢測方式,或許對你的實驗有用。

    分離培養法

    分離培養法是支原體檢測的金標方法,其檢測精確度*高。這種方法是從可疑的細胞培養體系中取樣,并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會在這種瓊脂平板上生長,最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養法基本不會出現假陰性結果,因此被譽為支原體檢測金標準。

    但是,分離培養法也存在兩個弊端,一是檢測時間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數支原體種類,分離培養法也有力所不及的時候,例如支原體M. hyorhinis。

    DNA檢測法,也稱直接培養法

    將可疑樣品與指示細胞共同培養,一般需要幾天時間。DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質區域較大的Vero細胞,如果原樣本中含有支原體,那么當細胞DNA被熒光染料(如Hoechst染料)染色時,就可以在指示細胞的核周圍觀察到熒光斑點或熒光顆粒。

    但是這種方法靈敏度太低,當檢測成陽性時,細胞經常已經嚴重污染。且Hoechst熒光染色:操作復雜,操作不當易造成假陽性或假陰性。

    PCR法

    市面上有許多商機提供基于PCR的支原體檢測試劑盒,如GeneCopoeia。這種方法已經比較成熟,應用的范圍也較為廣泛。

    PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本,其PCR引物可特異擴增支原體基因組中rDNA保守序列,包括所有已知的支原體,及細胞培養過程普遍遇到的種屬,例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過程中,支原體DNA會顯示為特異性條帶,以此指示支原體的存在。

    PCR法快速,簡便,具有強擴增能力和很高的敏感性,可以檢測大多數支原體,但謹慎起見最好同時使用另一種檢測方法來進行驗證。PCR法檢測支原體只需幾個小時,是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。

    酶學檢測

    酶學檢測是將可疑樣本添加到特定底物中,在這一體系內支原體的酶可以將ADP轉化為ATP,隨后能利用ATP發光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。

    最后,建議你進行定期檢測

    支原體感染會影響細胞的正常生長,因此對培養細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應該進行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去,是細胞培養實驗室應對支原體感染的關鍵。

    通常來說,被污染的細胞應該丟棄,以避免成為污染源。但對于珍貴的細胞,以往別的品牌的支原體清除劑,其實只是抑制劑,它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成,但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌,可與支原體膜特異性結合,破壞膜通透性,導致支原體膨脹破裂而死。

     

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